pmedpharmФармация и фармакологияPharmacy & Pharmacology2307-92662413-2241Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical Univer10.19163/2307-9266-2021-9-3-205-221pmedpharm-862Research ArticleФАРМАКОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯPHARMACOLOGY AND CLINICAL PHARMACOLOGYЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА VMU-2012-05 – ОРИГИНАЛЬНОГО НЕНУКЛЕОЗИДНОГО ИНГИБИТОРА ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИЧ-1EXPERIMENTAL STUDY OF TOXIC PROPERTIES OF VMU-2012-05 DRUG – ORIGINAL NON-NUCLEESIDE INHIBITOR OF HIV-1 REVERSE TRANSCRIPTASEhttps://orcid.org/0000-0002-1009-3963ВавиловаВ. А.VavilovaV. A.

фармаколог 1 категории отдела экспериментальной фармакологии и токсикологии 

pharmacologist of the 1st category of the Department of Experimental Pharmacology and Toxicology

vavilova.va@doclinika.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2689-6891ШекуноваЕ. В.ShekunovaE. V.

кандидат биологических наук, руководитель отдела экспериментальной фармакологии и токсикологии

Candidate of Sciences (Biology), Head of the Department of Experimental Pharmacology and Toxicology

shekunova.ev@doclinika.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0283-8598Джайн (Корсакова)Е. А.Jain (Korsakova)E. A.

аспирант кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии и организации фармацевтического дела факультета фундаментальной медицины 

Postgraduate student of the Department of Pharmaceutical Chemistry, Pharmacognosy and Organization of Pharmaceutical Business, Faculty of Fundamental Medicine

ekaterina.korsa@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-5744-7060БалабаньянВ. Ю.BalabanyanV. Yu.

доктор фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической технологии факультета фундаментальной медицины 

Doctor of Sciences (Pharmacy), Associate Professor of the Department of Pharmaceutical Technology, Faculty of Fundamental Medicine

bal.pharm@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4721-0959ОзеровА. А.OzerovA. A.

доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии

Doctor of Sciences (Chemistry), Professor, Head of the Department of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry

prof_ozerov@yahoo.comhttps://orcid.org/0000-0003-3176-6386МакароваМ. Н.MakarovaM. N.

доктор медицинских наук, заместитель ген. директора по науке 

Doctor of Sciences (Medicine), General Director, Director of Research

makarova.mn@doclinika.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2447-7888МакаровВ. Г.MakarovV. G.

доктор медицинских наук, профессор, генеральный директор 

Doctor of Sciences (Medicine), Professor, Deputy General Director 

makarov.vg@doclinika.ruАкционерное общество «Научно-производственное объединение «ДОМ ФАРМАЦИИ» 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, г. п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, корп. 245Россия«Research-and manufacturing company «НОМЕ OF РНАRМАСУ» Joint Stock Company Bldg. 245, 3, Zavodskaya St., Vil. Kuzmolovsky, Vsevolozhsky Dist., Leningrad Reg., Russia, 188663Russian FederationФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» 119991, Россия, г. Москва, Ломоносовский пр-т., дом 27, корп. 1РоссияMoscow State University named after M.V. Lomonosov Bldg. 1, 27, Lomonosov Ave., Moscow, Russia, 119991Russian FederationФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации 400131, Россия, г. Волгоград, площадь Павших Борцов, д. 1РоссияVolgograd State Medical University 1, Pavshikh Bortsov Sq., Volgograd, Russia, 400131Russian Federation20212008202193205221Copyright © Вавилова В.А., Шекунова Е.В., Джайн (Корсакова) Е.А., Балабаньян В.Ю., Озеров А.А., Макарова М.Н., Макаров В.Г., 20212021Вавилова В.А., Шекунова Е.В., Джайн (Корсакова) Е.А., Балабаньян В.Ю., Озеров А.А., Макарова М.Н., Макаров В.Г.Vavilova V.A., Shekunova E.V., Jain (Korsakova) E.A., Balabanyan V.Y., Ozerov A.A., Makarova M.N., Makarov V.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pharmpharm.ru/jour/article/view/862

Антиретровирусная терапия в настоящее время является основным компонентом лечения больных ВИЧ-инфекцией. Разработка новых более эффективных и более безопасных препаратов, является актуальной задачей.

Цель

Цель. Изучение токсических свойств готовой лекарственной формы (ГЛФ) VMU-2012-05- ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы (1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацил) для лечения ВИЧ-1 инфекции при однократном и многократном энтеральном введении.

Материалы и методы

Материалы и методы. Изучение токсических свойств при однократном введении проводили на беспородных мышах, препарат вводили в лимитирующей дозе 2000 мг/кг (по активному веществу). Токсические свойства при многократном ежедневном, в течение 90 дней, введении изучали на крысах обоего пола в дозах 0 мг/кг (плацебо), 9 мг/кг (1 ВТД), 45 мг/кг (5 ВТД), 90 мг/кг (10 ВТД) и кроликах обоего пола при 28-дневном  введении в дозах 0 мг/кг, 4 мг/кг (1 ВТД), 20 мг/кг (5 ВТД), 40 мг/кг (10 ВТД), период отсроченного наблюдения – 30 дней. В ходе эксперимента проводили клинические наблюдения и осмотры, регистрацию массы тела, проводили физиологические и клинико-лабораторные исследования. По окончании периода введения (50% животных) и по окончании периода отсроченного наблюдения проводили патоморфологическое исследование.

Результаты

Результаты. ЛД50 препарата – более 2000 мг/кг. При многократном введении установлен уровень доз, не вызывающих нежелательных эффектов (NOAEL), который для крыс составил 9 мг/кг (1 ВТД), для кроликов – 4 мг/кг (1 ВТД). По результатам экспериментов, проведенных на кроликах и крысах, основной орган-мишень токсического действия препарата – печень. По данным, полученным в исследовании на крысах, показано токсическое влияние на органы мужской репродуктивной системы (гипоплазия сперматогенного эпителия). Препарат в условиях проведенного эксперимента не оказал влияния на органы ЖКТ.

Заключение

Заключение. Результаты показали, что препарат обладает благоприятным профилем безопасности, не уступающим показателям применяемых в клинической практике препаратов аналогичной фармакологической группы, и может рассматриваться как перспективный лекарственный кандидат для лечения ВИЧ-1 инфекции.

Antiretroviral therapy is currently the main component of treatment for HIV patients. The development of new, more effective and safer drugs is an urgent task.

The aim of the research is to study the toxic properties of the finished dosage form (FDF) VMU-2012-05, a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor (1-[2-(2-benzoylphenoxy)ethyl]-6-methyluracil) for the HIV-1 infection treatment in single and repeated enteral administrations.

Materials and methods

Materials and methods. The study of toxic properties in single administrations was carried out on outbred mice; the drug was administered at the limiting dose of 2000 mg/kg (by reference to the active substance). For 90 days, in repeated daily administrations, the toxic properties were studied in rats of both sexes at the doses of 0 mg/kg (placebo), 9 mg/kg (1 HTD), 45 mg/kg (5 HTD), 90 mg/kg (10 HTD). The toxic properties were also studied in rabbits of both sexes within a 28-day administration at the doses of 0 mg/kg, 4 mg/kg (1 HTD), 20 mg/kg (5 HTD), 40 mg/kg (10 HTD); the recovery period 30 days. Clinical observations and examinations, body weight registrations, physiological and clinical laboratory studies were carried out during the experiment. At the end of the administration period (50% of animals) and at the end of the recovery period, a pathological examination was performed.

Results

Results. The LD50 of the drug is more than 2000 mg/kg. In the repeated administrations, the no observed adverse effect level (NOAEL) has been established. For rats, it is 9 mg/kg (1 HTD), for rabbits – 4 mg/kg (1 HTD). According to the results of the experiments carried out on rabbits and rats, the main target organ of the drug toxic effect is the liver. According to the data obtained in the study on rats, a toxic effect on the organs of the male reproductive system has been manifested (hypoplasia of the spermatogenic epithelium). Under the conditions of the experiment, the test drug had no effect on the gastrointestinal tract.

Conclusion

Conclusion. The results have manifested a favorable safety profile of the drug, not inferior to the ones of a similar pharmacological group used in clinical practice; it can be considered a promising drug candidate for the HIV-1 infection treatment.

доклинические исследованияВИЧ-1VMU-2012-051-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилтоксичностьоднократное введениемногократное введениеpreclinical studiesHIV-1VMU-2012-051-[2-(2-benzoylphenoxy) ethyl]-6-methyluraciltoxicitysingle administrationrepeated administrationРабота выполнена в рамках государственного контракта № 14.N08.11.0154 на выполнение прикладных научных исследований и экспериментальных разработок по теме «Доклинические исследования лекарственного средства на основе пиримидинового производного бензофенона для лечения ВИЧ-1 инфекций»The work was carried out under the government contract No. 14.N08.11.0154 for the implementation of applied research and experimental development on the topic “Preclinical studies of a drug based on a pyrimidine derivative of benzophenone for HIV-1 infections treatment”.ReferencesKemnic TR, Gulick PG. HIV Antiretroviral Therapy. [Updated 2021 Jun 25]. In: Stat Pearls Treasure Island (FL): Stat Pearls Publishing; 2021. [Электронный ресурс]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK513308/Kemnic TR, Gulick PG. HIV Antiretroviral Therapy. [Updated 2021 Jun 25]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK513308/Yoshida Yu., Honma M., Kimura Y., Abe H. Structure, Synthesis and Inhibition Mechanism of Nucleoside Analogues as HIV-1 Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs) // Chem. Med. Chem. – 2021. – Vol. 16, No.5. – P. 743–766. DOI: 10.1002/cmdc.202000695.Yoshida Y, Honma M, Kimura Y, Abe H. Structure, Synthesis and Inhibition Mechanism of Nucleoside Analogues as HIV-1 Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs). ChemMedChem. 2021 Mar 3;16(5):743–66. DOI: 10.1002/cmdc.202000695.Wang Y., De Clercq E., Li G. Current and emerging non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) for HIV-1 treatment // Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. – 2019. – Vol. 15, No.10. – P. 813–829. DOI: 10.1080/17425255.2019.1673367.Wang Y, De Clercq E, Li G. Current and emerging non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) for HIV-1 treatment. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2019 Oct;15(10):813–29. DOI: 10.1080/17425255.2019.1673367.Xu W., Pu J., Su S., Hua C., Su X., Wang Q., Jiang S., Lu L. Revisiting the mechanism of enfuvirtide and designing an analog with improved fusion inhibitory activity by targeting triple sites in gp41 // AIDS. – 2019. – Vol. 33, No.10. – P. 1545–1555. DOI: 10.1097/QAD.0000000000002208.Xu W, Pu J, Su S, Hua C, Su X, Wang Q, Jiang S, Lu L. Revisiting the mechanism of enfuvirtide and designing an analog with improved fusion inhibitory activity by targeting triple sites in gp41. AIDS. 2019 Aug 1;33(10):1545–55. DOI: 10.1097/QAD.0000000000002208.Chandrashekhar Voshavar, Protease Inhibitors for the Treatment of HIV/AIDS: Recent Advances and Future Challenges // Curr. Top. Med. Chem. – 2019. – Vol. 19, No.18. – P. 1571–1598. DOI: 10.2174/1568026619666190619115243.Voshavar C. Protease Inhibitors for the Treatment of HIV/AIDS: Recent Advances and Future Challenges. Curr Top Med Chem. 2019;19(18):1571–98. DOI: 10.2174/1568026619666190619115243.López-Huertas, M.R., Jiménez-Tormo L., Madrid-Elena N., Gutiérrez C., Rodríguez-Mora S., Coiras M., Alcamí J., Santiago M. The CCR5-antagonist Maraviroc reverses HIV-1 latency in vitro alone or in combination with the PKC-agonist Bryostatin-1 // Sci Rep. – 2017. – Vol. 7, No.1. – P. 2385. DOI: 10.1038/s41598-017-02634-y.López-Huertas, MR, Jiménez-Tormo L, Madrid-Elena N, Gutiérrez C, Rodríguez-Mora S, Coiras M, Alcamí J, Santiago M. The CCR5-antagonist Maraviroc reverses HIV-1 latency in vitro alone or in combination with the PKC-agonist Bryostatin-1. Sci Rep. 2017;7(1): 2385. DOI: 10.1038/s41598-017-02634-y.Trivedi J., Mahajan D., Jaffe R.J., Acharya A., Mitra D., Byrareddy S.N. Recent Advances in the Development of Integrase Inhibitors for HIV Treatment // Curr HIV/AIDS Rep. – 2020. – Vol. 17, No.1. – P. 63–75. DOI: 10.1007/s11904-019-00480-3.Trivedi J, Mahajan D, Jaffe RJ, Acharya A, Mitra D, Byrareddy SN. Recent Advances in the Development of Integrase Inhibitors for HIV Treatment. Curr HIV/AIDS Rep. 2020 Feb;17(1):63–75. DOI: 10.1007/s11904-019-00480-3.Blair H.A. Ibalizumab: A Review in Multidrug-Resistant HIV-1 Infection // Drugs. – 2020. – Vol. 80, No.2. – P. 189–196. DOI: 10.1007/s40265-020-01258-3.Blair HA. Ibalizumab: A Review in Multidrug-Resistant HIV-1 Infection. Drugs. 2020 Feb;80(2):189–96. DOI: 10.1007/s40265-020-01258-3.Deeks E.D. Darunavir/Cobicistat/Emtricitabine/Tenofovir Alafenamide: A Review in HIV-1 Infection // Drugs. – 2018. – Vol. 78, No.10. – P. 1013–1024. DOI: 10.1007/s40265-018-0934-2.Deeks ED. Darunavir/Cobicistat/Emtricitabine/Tenofovir Alafenamide: A Review in HIV-1 Infection. Drugs. 2018 Jul;78(10):1013–24. DOI: 10.1007/s40265-018-0934-2.Eggleton J.S., Nagalli S. Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART). Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, 2021.Eggleton JS, Nagalli S. Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART). 2021 Jul 8. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021.Dionne B. Key Principles of Antiretroviral Pharmacology // Infect Dis Clin North Am. – 2019. – Vol. 33, No.3. – P. 787–805. DOI: 10.1016/j.idc.2019.05.006.Dionne B. Key Principles of Antiretroviral Pharmacology. Infect Dis Clin North Am. 2019 Sep;33(3):787–805. DOI: 10.1016/j.idc.2019.05.006.Rothenberg R., Woelfel M., Stoneburner R., Milberg J., Parker R., Truman B. Survival with the acquired immunodeficiency syndrome. Experience with 5833 cases in New York City // N Engl J Med. – 1987. – Vol. 317, No.21. – P. 1297–1302. DOI: 10.1056/NEJM198711193172101Rothenberg R, Woelfel M, Stoneburner R, Milberg J, Parker R, Truman B. Survival with the acquired immunodeficiency syndrome. Experience with 5833 cases in New York City. N Engl J Med. 1987 Nov 19;317(21):1297–302. DOI: 10.1056/NEJM198711193172101.Hellinger F.J. The lifetime cost of treating a person with HIV // JAMA. – 1993. – Vol. 270, No.4. – P. 474–478. DOI:10.1001/jama.1993.03510040078033Hellinger FJ. The lifetime cost of treating a person with HIV. JAMA. 1993;270(4):474–8. DOI:10.1001/jama.1993.03510040078033.Marcus J.L., Chao C.R., Leyden W.A., Xu L., Quesenberry C.P. Jr., Klein D.B., Towner W.J., Horberg M.A., Silverberg M.J. Narrowing the gap in life expectancy between HIV-infected and HIV-uninfected individuals with access to care // J Acquir Immune Defic Syndr. – 2016. – Vol. 73, No.3. – P. 39–46. DOI: 10.1097/QAI.0000000000001014.Marcus JL, Chao CR, Leyden WA, Xu L, Quesenberry CP Jr, Klein DB, Towner WJ, Horberg MA, Silverberg MJ. Narrowing the Gap in Life Expectancy Between HIV-Infected and HIV-Uninfected Individuals With Access to Care. J Acquir Immune Defic Syndr. 2016 Sep 1;73(1):39–46. DOI: 10.1097/QAI.0000000000001014.Fauci A.S., Marston H.D. Ending the HIV-AIDS pandemic—follow the science // N Engl J Med. – 2015. – Vol. 373. – P. 2197–2199. DOI: 10.1056/NEJMp1502020.Fauci AS, Marston HD. Ending the HIV-AIDS Pandemic--Follow the Science. N Engl J Med. 2015 Dec 3;373(23):2197–9. DOI: 10.1056/NEJMp1502020.Wood E., Montaner J.S., Bangsberg D.R., Tyndall M.W., Strathdee S.A., O’Shaughnessy M.V., Hogg R.S. Expanding access to HIV antiretroviral therapy among marginalized populations in the developed world // AIDS. – 2003. – Vol. 17. – P. 2419–2427. DOI:10.1097/00002030-200311210-00003.Wood E, Montaner JS, Bangsberg DR, Tyndall MW, Strathdee SA, O’Shaughnessy MV, Hogg RS. Expanding access to HIV antiretroviral therapy among marginalized populations in the developed world. AIDS. 2003 Nov 21;17(17):2419–27. DOI: 10.1097/00002030-200311210-00003.Gupta R.K. Gregson J., Parkin N., et al. HIV-1 drug resistance before initiation or re-initiation of first-line antiretroviral therapy in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-regression analysis // Lancet Infect Dis. – 2018. – Vol. 18, No.3. – P. 346–355. DOI: 10.1016/S1473-3099(17)30702-8.Gupta RK, Gregson J, Parkin N, et al. HIV-1 drug resistance before initiation or re-initiation of first-line antiretroviral therapy in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-regression analysis. Lancet Infect Dis. 2018 Mar;18(3):346–55. DOI: 10.1016/S1473-3099(17)30702-8.Tang M.W., Shafer R.W. HIV-1 antiretroviral resistance: scientific principles and clinical applications // Drugs. – 2012. – Vol. 72, No.9. – P. 1–25. DOI: 10.2165/11633630-000000000-00000.Tang MW, Shafer RW. HIV-1 antiretroviral resistance: scientific principles and clinical applications. Drugs. 2012 Jun 18;72(9):e1–25. DOI: 10.2165/11633630-000000000-00000.Chawla A., Wang C., Patton C., Murray M., Punekar Y., de Ruiter A., Steinhart C. A Review of Long-Term Toxicity of Antiretroviral Treatment Regimens and Implications for an Aging Population // Infect Dis Ther. – 2018. – Vol. 7, No.2. – P. 183–195. DOI: 10.1007/s40121-018-0201-6.Chawla A, Wang C, Patton C, Murray M, Punekar Y, de Ruiter A, Steinhart C. A Review of Long-Term Toxicity of Antiretroviral Treatment Regimens and Implications for an Aging Population. Infect Dis Ther. 2018 Jun;7(2):183–95. DOI: 10.1007/s40121-018-0201-6.Еременко Н.Н., Губенко А.И., Зебрев А.И., Лысикова И.В. Современные подходы в лечении ВИЧ-инфицированных больных // Ведомости НЦЭСМП. – 2014 – № 2. – С. 40–45.Eremenko NN, Gubenko AI, Zebrev AI, Lysikova IV. Sovremennye podhody v lechenii VICH-inficirovannyh bol’nyh [Modern approaches in the treatment of HIV-infected patients]. Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products=Vedomosti NCESMP. 2014;2:40–5. RussianПетров В.И., Озеров А.А., Луганченко А.И. Пиримидиновые производные бензофенона, обладающие анти-ВИЧ-1 активностью. Пат. России № 2489427 (2013). – Опубл. 10.08.2013. Бюлл. № 22.Petrov VI, Ozerov AA, Luganchenko AI. Pyrimidine derivatives of benzophenone with anti-HIV-1 activity. Russian Federation Patent 2489427. 2013 Oct 08.Novikov M.S., Ivanova O.N., Ivanov A.V., Valuev-Elliston V.T., Tembumikar K., Ozerov A.A., Gurskaya G.V., Kochetkov S.N., Pannecouque C., Balzarini J., Seley-Radtke K.S. 1-[2-(2-Benzoyl-and 2-benzyl-phenoxy)ethyl]uracilsaspotent anti-HIV-1 agents // Bioorg. Med. Chem. – 2011. – Vol. 19, No.19. – P. 5794–5802. DOI: 10.1016/j.bmc.2011.08.025.Novikov MS, Ivanova ON, Ivanov AV, Ozerov AA, Valuev-Elliston VT, Temburnikar K, Gurskaya GV, Kochetkov SN, Pannecouque C, Balzarini J, Seley-Radtke KL. 1-[2-(2-Benzoyl- and 2-benzylphenoxy)ethyl]uracils as potent anti-HIV-1 agents. Bioorg Med Chem. 2011 Oct 1;19(19):5794–802. DOI: 10.1016/j.bmc.2011.08.025.Аронин С.И. ВИЧ-инфекция: вопросы терапии // Казанский медицинский журнал. – 2005. – Т. 86, №6. – C. 433–450.Aronin SI. VICH-infekciya: voprosy terapii [HIV infection: issues of therapy] // Kazan Medical Journal=Kazanskij medicinskij zhurnal. 2005;86(6): 433–50. RussianCreasy D., Bube A., De Rijk E., Kandori H., Kuwahara M., Masson R., Nolte T., Reams R., Regan K., Rehm S., Rogerson P., Whitney K. Proliferative and nonproliferative lesions of the rat and mouse male reproductive system // J. Toxicol. Pathol. – 2012. – Vol. 40. – P. 40–121. DOI: 10.1177/0192623312454337.Creasy D, Bube A, de Rijk E, Kandori H, Kuwahara M, Masson R, Nolte T, Reams R, Regan K, Rehm S, Rogerson P, Whitney K. Proliferative and nonproliferative lesions of the rat and mouse male reproductive system. Toxicol Pathol. 2012 Aug;40(6 Suppl):40S–121S. DOI: 10.1177/0192623312454337.Uehara T., Elmore S. A., Szabo K. A. Esophagus and stomach. Chapter 6. Boorman’s Pathology of the Rat (Second Edition), Academic Press, 2018. – P. 35–50. DOI: 10.1016/B978-0-12-391448-4.00006-X.Uehara T, Elmore SA, Szabo K. A. Esophagus and stomach. Chapter 6. Boorman’s Pathology of the Rat (Second Edition), Academic Press, 2018: 35–50. DOI: 10.1016/B978-0-12-391448-4.00006-X.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.