СОЗДАНИЕ КЛОНА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШЕЙ С КОНДИЦИОННЫМ НОКАУТОМ ГУМАНИЗИРОВАННОГО ГЕНА SNCA

Одним из ключевых молекулярных звеньев в патогенезе болезни Паркинсона является белок α-синуклеин. Накопленные данные свидетельствуют о том, что патогенные мутации в гене Snca ассоциированы с развитием нейродегенеративного повреждения головного мозга, тем самым указывая на актуальность изучения нейробиологической роли α-синуклеина.

Цель. Создание генетически-модифицированного клона стволовых клеток мышей с кондиционным нокаутом гуманизированного α-синуклеина, который может быть использован для реинъекции в мышиные бластоцисты, а также для фундаментальных и прикладных in vitro исследований в области патофизиологии и нейрофармакологии.

Материалы и методы. Для создания мышиных стволовых клеток с кондиционным нокаутом гуманизированного гена Snca был использован прежде полученный клон с фланкированным LoxP-сайтами первым экзоном Snca. Для гуманизации IV и V экзона была использована система CRISPR/Cas9-опосредованной гомологичной рекомбинации с донорными ДНК олигонуклеотидами человеческих сайтов соответствующих генов. Нуклеаза Cas9, гидовые РНК и донорная ДНК были трансфецированы в клетки мыши.

Результаты. Нами был предложен и реализован подход к получению клонов мышиных генетически-модифицированных стволовых клеток, экспрессирующих патологический гуманизированный α-синуклеин. Полученные клоны были высеяны на чашки Петри для размножения и дальнейшего генетического анализа. Был обнаружен клон 126-2F4, несущий необходимые генетические модификации. Результаты проведенного исследования принципиально важны не только для понимания развития патологического процесса при α-синуклеинопатиях, но и, что ещё важнее, для разработки новых терапевтических подходов, которые позволят остановить распространение агрегационной патологии человеческого α-синуклеина по нервной системе и валидации этих подходов в доклинических испытаниях.

Заключение. В результате проведенного исследования разработана стратегия CRISPR/Cas9-ассистированной гомологической рекомбинации в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши для создания полностью гуманизированного гена Snca, кодирующего α-синуклеин. Выполнено редактирование генома клона эмбриональных стволовых клеток мыши с использованием CRISPR технологии. Синтезированы РНК и ДНК олигонуклеотиды, необходимые для создания рибонуклеопротеиновых комплексов, осуществляющих направленную гомологическую рекомбинацию в Snca локусе генома мыши. Разработанный клон клеток может служить для создания линии генетически-модифицированных мышей, служащих тест-системой для патофизиологических и нейрофармакологических исследований, связанных с синуклеинопатиями. При этом до индукции Cre-зависимой рекомбинации данная линия является репрезентативной моделью для исследования биологической роли мутантного Snca. В то же время, после Cre-зависимая активация нокаута позволяет имитировать фармакологическое ингибирование α-синуклеина, что представляет особый интерес для прикладных исследований в нейрофармакологии.

1. Checkoway H., Lundin J.I., Kelada S.N. Neurodegenerative diseases // IARC Sci. Publ. – 2011. – P. 407–419.

2. Bougea A. Synuclein in neurodegeneration // Adv. Clin. Chem. – 2021. – Vol. 103. – P. 97–134. DOI: 10.1016/bs.acc.2020.08.007

3. Ozansoy M., Başak A.N. The central theme of Parkinson’s disease: α-synuclein // Mol Neurobiol. – 2013. – Vol. 47, No. 2. – P. 460–465. DOI: 10.1007/s12035-012-8369-3

4. George J.M. The synucleins // Genome Biol. – 2002. – Vol. 3, No. 1. – Art. ID: 3002. DOI: 10.1186/gb-2001-3-1-reviews3002

5. Breydo L., Wu J.W., Uversky V.N. Α-synuclein misfolding and Parkinson’s disease // Biochim. Biophys. Acta. – 2012. – Vol. 1822, No. 2. – P. 261–285. DOI: 10.1016/j.bbadis.2011.10.002

6. Iwai A., Masliah E., Yoshimoto M., Ge N., Flanagan L., de Silva H.A., Kittel A., Saitoh T. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer’s disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system // Neuron. – 1995. – Vol. 14, No. 2. – P. 467–475. DOI: 10.1016/0896-6273(95)90302-x

7. Lee S.J., Jeon H., Kandror K.V. Alpha-synuclein is localized in a subpopulation of rat brain synaptic vesicles // Acta Neurobiol. Exp. (Wars). – 2008. – Vol. 68, No. 4. – P. 509–515.

8. Lashuel H.A., Overk C.R., Oueslati A., Masliah E. The many faces of α-synuclein: from structure and toxicity to therapeutic target // Nat. Rev. Neurosci. – 2013. – Vol. 14, No. 1. – P. 38–48. DOI: 10.1038/nrn3406

9. Dalfó E., Ferrer I. Alpha-synuclein binding to rab3a in multiple system atrophy // Neurosci. Lett. – 2005. – Vol. 380, No. 1–2. – P. 170–175. DOI: 10.1016/j.neulet.2005.01.034

10. Burré J., Sharma M., Tsetsenis T., Buchman V., Etherton M.R., Südhof T.C. Alpha-synuclein promotes SNARE-complex assembly in vivo and in vitro // Science. – 2010. – Vol. 329, No. 5999. – P. 1663–1667. DOI: 10.1126/science.1195227

11. Ninkina N., Connor-Robson N., Ustyugov A.A., Tarasova T.V., Shelkovnikova T.A., Buchman V.L. A novel resource for studying function and dysfunction of α-synuclein: mouse lines for modulation of endogenous Snca gene expression // Sci. Rep. – 2015. – Vol. 5. – Art. ID: 16615. DOI: 10.1038/srep16615

12. Roman A.Y., Limorenko G., Ustyugov A.A., Tarasova T.V., Lysikova E.A., Buchman V.L., Ninkina N. Generation of mouse lines with conditionally or constitutively inactivated Snca gene and Rosa26-stop-lacZ reporter located in cis on the mouse chromosome 6 // Transgenic Res. – 2017. – Vol. 26, No. 2. – P. 301–307. DOI: 10.1007/s11248-016-9995-8

13. Chaprov K.D., Lysikova E.A., Teterina E.V., Buchman V.L. Kinetics of alpha-synuclein depletion in three brain regions following conditional pan-neuronal inactivation of the encoding gene (Snca) by tamoxifen-induced Cre-recombination in adult mice // Transgenic Res. – 2021. – Vol. 30, No. 6. – P. 867–873. DOI: 10.1007/s11248-021-00286-3

14. Krüger R., Kuhn W., Müller T., Woitalla D., Graeber M., Kösel S., Przuntek H., Epplen J.T., Schöls L., Riess O. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson’s disease // Nat. Genet. – 1998. – Vol. 18, No. 2. – P. 106–108. DOI: 10.1038/ng0298-106

15. Polymeropoulos M.H., Lavedan C., Leroy E., Ide S.E., Dehejia A., Dutra A., Pike B., Root H., Rubenstein J., Boyer R., Stenroos E.S., Chandrasekharappa S., Athanassiadou A., Papapetropoulos T., Johnson W.G., Lazzarini A.M., Duvoisin R.C., Di Iorio G., Golbe L.I., Nussbaum R.L. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease // Science. – 1997. – Vol. 276, No. 5321. – P. 2045–2047. DOI: 10.1126/science.276.5321.2045

16. Angelova P.R., Choi M.L., Berezhnov A.V., Horrocks M.H., Hughes C.D., De S., Rodrigues M., Yapom R., Little D., Dolt K.S., Kunath T., Devine M.J., Gissen P., Shchepinov M.S., Sylantyev S., Pavlov E.V., Klenerman D., Abramov A.Y., Gandhi S. Alpha synuclein aggregation drives ferroptosis: an interplay of iron, calcium and lipid peroxidation // Cell Death Differ. – 2020. – Vol. 27, No. 10. – P. 2781–2796. DOI: 10.1038/s41418-020-0542-z

17. Angelova P.R., Horrocks M.H., Klenerman D., Gandhi S., Abramov A.Y., Shchepinov M.S. Lipid peroxidation is essential for α-synuclein-induced cell death // J. Neurochem. – 2015. – Vol. 133, No. 4. – P. 582–589. DOI: 10.1111/jnc.13024

18. Choi M.L., Chappard A., Singh B.P., Maclachlan C., Rodrigues M., Fedotova E.I., Berezhnov A.V., De S., Peddie C.J., Athauda D., Virdi G.S., Zhang W., Evans J.R., Wernick A.I., Zanjani Z.S., Angelova P.R., Esteras N., Vinokurov A.Y., Morris K., Jeacock K., Tosatto L., Little D., Gissen P., Clarke D.J., Kunath T., Collinson L., Klenerman D., Abramov A.Y., Horrocks M.H., Gandhi S. Pathological structural conversion of α-synuclein at the mitochondria induces neuronal toxicity // Nat. Neurosci. – 2022. – Vol. 25, No. 9. – P. 1134–1148. DOI: 10.1038/s41593-022-01140-3. Erratum in: Nat. Neurosci. – 2022. – Vol. 25, No. 11. – Art. ID: 1582.

19. Choi M.L., Gandhi S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases // FEBS J. – 2018. – Vol. 285, No. 19. – P. 3631–3644. DOI: 10.1111/febs.14587

20. Srinivasan E., Chandrasekhar G., Chandrasekar P., Anbarasu K., Vickram A.S., Karunakaran R., Rajasekaran R., Srikumar P.S. Alpha-Synuclein Aggregation in Parkinson’s Disease // Front. Med. (Lausanne). – 2021. – Vol. 8. – Art. ID: 736978. DOI: 10.3389/fmed.2021.736978

21. Chaprov K.D., Goloborshcheva V.V., Tarasova T.V., Teterina E.V., Korokin M.V., Soldatov V.O., Pokrovskiy M.V., Kucheryanu V.G., Morozov S.G., Ovchinnikov R.K. Increased Expression of the Multimerin-1 Gene in α-Synuclein Knokout Mice // Dokl. Biol. Sci. – 2020. – Vol. 494, No. 1. – P. 260–263. DOI: 10.1134/S0012496620050014

22. Soldatov V.O., Kubekina M.V., Silaeva Yu.Yu., Bruter A.V., Deykin A.V. On the way from SARS-CoV-sensitive mice to murine COVID-19 model // Research Results in Pharmacology. – 2022. – Vol. 6, No. 2. – P. 1–7. DOI: 10.3897/rrpharmacology.6.53633

23. Bruter A.V., Korshunova D.S., Kubekina M.V., Sergiev P.V., Kalinina A.A., Ilchuk L.A., Silaeva Y.Y., Korshunov E.N., Soldatov V.O., Deykin A.V. Novel transgenic mice with Cre-dependent co-expression of GFP and human ACE2: a safe tool for study of COVID-19 pathogenesis. Transgenic Res. 2021 Apr 14;30(3):289–301. DOI: 10.1007/s11248-021-00249-8. Epub ahead of print.

24. Кузубова Е.В., Радченко А.И., Покровский В.М., Патраханов Е.А., Новикова А.А., Степенко Ю.В., Дейкин А.В. Патологические состояния, ассоциированные с белком тау: механизмы развития и возможные биологические мишени для фармакологической коррекции тау-протеинопатии (обзор) // Научные результаты биомедицинских исследований. – 2022. – Т. 8, № 4. – С. 474–797. DOI: 10.18413/2658-6533-2022-8-4-0-6

25. Dolskiy A.A., Gudymo A.S., Taranov O.S., Grishchenko I.V., Shitik E.M., Prokopov D.Y., Soldatov V.O., Sobolevskaya E.V., Bodnev S.A., Danilchenko N.V., Moiseeva A.A., Torzhkova P.Y., Bulanovich Y.A., Onhonova G.S., Ivleva E.K., Kubekina M.V., Belykh A.E., Tregubchak T.V., Ryzhikov A.B., Gavrilova E.V., Maksyutov R.A., Deykin A.V., Yudkin D.V. The Tissue Distribution of SARS-CoV-2 in Transgenic Mice With Inducible Ubiquitous Expression of hACE2 // Front. Mol. Biosci. – 2022. – Vol. 8. – Art. ID: 821506. DOI: 10.3389/fmolb.2021.821506