Разработка методики количественного определения оксида азота (NO) в тканях крыс с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии

Количественная оценка продукции оксида азота (NO) в тканях организма является актуальной задачей фармакологии и биохимии. Изучение физиологических процессов, протекающих с участием NO, а также метаболизма и фармакодинамики фармакологических средств из группы донаторов NO требует внедрения точных и воспроизводимых методик количественного определения данного метаболита в биологических средах.

Цель. Разработка ВЭЖХ-МС/МС методики количественного определения оксида азота в различных тканях крыс.

Материалы и методы. Непрямое количественное определение NO было основано на оценке уровня более стабильных метаболитов: нитритов и нитратов, которые извлекали из тканей крыс путем гомогенизации с водой. Восстановление нитратов до нитритов осуществляли с помощью нитрат редуктазы. В основе дериватизации нитритов использовали реакцию с реактивом Грисса. Полученный азокраситель определяли с помощью ВЭЖХ-МС/МС с использованием аналитической колонки Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4,6×100 мм, 2,7 мкм. Общее время хроматографического анализа составило 12 минут, время удерживания аналита составило 6,1 минут. Аналитический диапазон методики составил 0,1–100,0 нмоль (в пересчете на нитрит) на 1 мл плазмы или гомогената ткани.

Результаты. Разработанная биоаналитическая методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, матричный эффект, степень извлечения, перенос пробы, линейность аналитического диапазона, нижний предел количественного определения (НПКО), внутри- и межсерийная точность и прецизионность, стабильность на всех этапах анализа. Для апробации методики было проведено определение содержания NO в плазме, головном мозге, сердце, аорте и легких крыс.

Заключение. Разработанная биоаналитическая ВЭЖХ-МС/МС-методика полностью соответствует валидационным требованиям. Метрологические характеристики методики позволяют с высокой точностью оценить продукцию NO в различных тканях крыс, что, несомненно, представляет актуальным и востребованным в исследовании патологических процессов, а также механизма действия фармакологических средств из группы донаторов NO.

1. Ignarro L.J. Nitric oxide is not just blowing in the wind // Br J Pharmacol. – 2019. – Vol. 176, No. 2. – P. 131. DOI: 10.1111/bph.14540

2. Lundberg J.O., Weitzberg E. Nitric oxide signaling in health and disease // Cell. – 2022. – Vol. 185, No. 16. – P. 2853–2878. DOI: 10.1016/j.cell.2022.06.010

3. Zweier J.L., Ilangovan G. Regulation of nitric oxide metabolism and vascular tone by cytoglobin // Antioxid Redox Signal. – 2020. – Vol. 32, No. 16. – P. 1172–1187. DOI: 10.1089/ars.2019.7881

4. Gupta R.M., Libby P., Barton M. Linking regulation of nitric oxide to endothelin-1: The Yin and Yang of vascular tone in the atherosclerotic plaque // Atherosclerosis. – 2020. – Vol. 292. – P. 201–203. DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2019.11.001

5. Enayati M., Schneider K.H., Almeria C., Grasl C., Kaun C., Messner B., Rohringer S., Walter I., Wojta J., Budinsky L., Walpoth B.H., Schima H., Kager G., Hallström S., Podesser B.K., Bergmeister H. S-nitroso human serum albumin as a nitric oxide donor in drug-eluting vascular grafts: Biofunctionality and preclinical evaluation // Acta Biomater. – 2021. – Vol. 134. – P. 276–288. DOI: 10.1016/j.actbio.2021.07.048

6. Shvetsova A.A., Borzykh A.A., Selivanova E.K., Kiryukhina O.O., Gaynullina D.K., Tarasova O.S. Intrauterine Nitric Oxide Deficiency Weakens Differentiation of Vascular Smooth Muscle in Newborn Rats // Int J Mol Sci. – 2021. – Vol. 22, No. 15. – P. 8003. DOI: 10.3390/ijms22158003

7. Grigorieva M.E., Myasoedov N.F., Lyapina L.A. Participation of Nitric Oxide in the Realization of Hemostatic Effects of Glyproline Peptides // Dokl Biochem Biophys. 2022. – Vol. 506, No. 1. – P. 177–180. DOI: 10.1134/S1607672922050052

8. Norooznezhad A.H., Mansouri K. Endothelial cell dysfunction, coagulation, and angiogenesis in coronavirus disease 2019 (COVID-19) // Microvasc Res. – 2021. – Vol. 137. – P. 104188. DOI: 10.1016/j.mvr.2021.104188

9. Wallace J.L. Nitric oxide in the gastrointestinal tract: opportunities for drug development // Br J Pharmacol. – 2019. – Vol. 176, No. 2. – Р. 147–154. DOI: 10.1111/bph.14527

10. Sanders K.M., Ward S.M. Nitric oxide and its role as a non-adrenergic, non-cholinergic inhibitory neurotransmitter in the gastrointestinal tract // Br J Pharmacol. – 2019. – Vol. 176, No. 2. – P. 212–227. DOI: 10.1111/bph.14459

11. Tripathi M.K., Kartawy M., Amal H. The role of nitric oxide in brain disorders: Autism spectrum disorder and other psychiatric, neurological, and neurodegenerative disorders // Redox Biol. – 2020. – Vol. 34. – P. 101567. DOI: 10.1016/j.redox.2020.101567

12. Ghasemi M., Mayasi Y., Hannoun A., Eslami S.M., Carandang R. Nitric oxide and mitochondrial function in neurological diseases // Neuroscience. – 2018. – Т. 376. – Р. 48–71. DOI: 10.1016/j.neuroscience.2018.02.017

13. Tewari D., Sah A.N., Bawari S., Nabavi S.F., Dehpour A.R., Shirooie S., Nabavi S.M. Role of nitric oxide in neurodegeneration: function, regulation, and inhibition // Curr Neuropharmacol. – 2021. – Vol. 19, No. 2. – P. 114–126. DOI: 10.2174/1570159X18666200429001549

14. Green S.J. Covid-19 accelerates endothelial dysfunction and nitric oxide deficiency // Microbes Infect. – 2020. – Vol. 22, No. 4. – P. 149. DOI: 10.1016/j.micinf.2020.05.006

15. Xu S., Ilyas I., Little P.J., Li H., Kamato D., Zheng X., Weng J. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: from mechanism to pharmacotherapies // Pharmacological Reviews. – 2021. – Vol. 73, No. 3. – P. 924–967. DOI: 10.1124/pharmrev.120.000096

16. Cetin M., Erdogan T., Kiris T., Ozyildiz A.G., Ergul E., Durakoglugil E., Cicek Y. Endothelial dysfunction, subclinical atherosclerosis and LDL cholesterol are the independent predictors of left atrial functions in hypertension // Int J Cardiovasc Imaging. – 2020. – Vol. 36, No. 1. – P. 69–77. DOI: 10.1007/s10554-019-01699-2

17. Feelisch M. The use of nitric oxide donors in pharmacological studies // Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. – 1998. – Vol. 358, No. 1. – P. 113–122. DOI: 10.1007/PL00005231

18. Sun J., Zhang X., Broderick M., Fein H. Measurement of nitric oxide production in biological systems by using Griess reaction assay // Sensors. – 2003. – Vol. 3, No. 8. – P. 276–284. DOI: 10.3390/s30800276

19. Ricart-Jane D., Llobera M., Lopez-Tejero M.D. Anticoagulants and other preanalytical factors interfere in plasma nitrate/nitrite quantification by the Griess method // Nitric Oxide. – 2002. – Vol. 6, No. 2. – P. 178–185. DOI: 10.1006/niox.2001.0392

20. Yucel A.A., Gulen S., Dincer S., Yucel A.E., Yetkin G.I. Comparison of two different applications of the Griess method for nitric oxide measurement // J Exp Integr Med. – 2012. – Vol. 2, No. 1. – P. 167. DOI: 10.5455/jeim.200312.or.024

21. Hunter R.A., Storm W. L., Coneski P.N., Schoenfisch M.H. Inaccuracies of nitric oxide measurement methods in biological media // Analytical chemistry. – 2013. – Vol. 85, No. 3. – P. 1957–1963. DOI: 10.1021/ac303787p

22. Aziz H.A., Moustafa G.A.I., Abbas S.H., Derayea S.M., Abuo G.E.D.A.A. New norfloxacin/nitric oxide donor hybrids: Synthesis and nitric oxide release measurement using a modified Griess colorimetric method // Eur J Chem. – 2017. – Vol. 8, No. 2. – P. 119–124. DOI: 10.5155/eurjchem.8.2.119-124.1549

23. Minkler P., Stoll M., Ingalls S., Yang S., Kerner J., Hoppel C.L. Quantification of carnitine and acylcarnitines in biological matrices by HPLC electrospray ionization–mass spectrometry // Clin Chem. – 2008. – Vol. 54. – P. 1451–1462. DOI: 10.1373/clinchem.2007.099226

24. Гуманова Н.Г. Оксид азота, его циркулирующие метаболиты NOx и их роль в функционировании человеческого организма и прогнозе риска сердечно-сосудистой смерти (часть I) // Профилактическая медицина. – 2021. – Т. 24, № 9. – С. 119–125. DOI: 10.17116/profmed202124091102

25. Fang W., Jiang J., Su L., Shu T., Liu H., Lai S., Wang J. The role of NO in COVID-19 and potential therapeutic strategies // Free Radic Biol Med. – 2021. – Vol. 163. – P. 153–162. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2020.12.008

26. Попов Н.С., Балабаньян В.Ю., Колгина Н.Ю., Петров Г.А., Донсков С.А., Атаджанов И.Б. Количественное определение циклического гуанозинмонофосфата (ц-ГМФ) в тканях крыс с помощью жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии // Фармакокинетика и фармакодинамика. – 2023. – № 3. – С. 28–38. DOI: 10.37489/2587-7836-2023-3-28-38

27. Infante T., Costa D., Napoli C. Novel insights regarding nitric oxide and cardiovascular diseases // Angiology. – 2021. – Vol. 72, No. 5. – P. 411–425. DOI: 10.1177/00033197209792

28. Idrizaj E., Traini C., Vannucchi M.G., Baccari M.C. Nitric oxide: from gastric motility to gastric dysmotility // Int J Mol Sci. – 2021. – Vol. 22, No. 18. – P. 9990. DOI: 10.3390/ijms22189990

29. Yaguchi J., Yaguchi S. Evolution of nitric oxide regulation of gut function // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2019. – Vol. 116, No. 12. – P. 5607–5612. DOI: 10.1073/pnas.1816973116

30. Morales-Medina J.C., Aguilar-Alonso P., Di Cerbo A., Iannitti T., Flores G. New insights on nitric oxide: Focus on animal models of schizophrenia // Behavioural Brain Research. – 2021. – Vol. 409. – P. 113304. DOI: 10.1016/j.bbr.2021.113304

31. Cyr A.R., Huckaby L.V., Shiva S.S., Zuckerbraun B.S. Nitric oxide and endothelial dysfunction // Crit Care Clin. – 2020. – Vol. 36, No. 2. – P. 307–321. DOI: 10.1016/j.ccc.2019.12.009

32. AbdelAziz E.Y., Tadros M.G., Menze E.T. The effect of metformin on indomethacin-induced gastric ulcer: Involvement of nitric oxide/Rho kinase pathway // Eur J Pharmacol. – 2021. – Vol. 892. – P. 173812. DOI: 10.1016/j.ejphar.2020.173812

33. Cieślik P., Kalinowski L., Wierońska J.M. Procognitive activity of nitric oxide inhibitors and donors in animal models // Nitric Oxide. – 2022. – Vol. 119. – P. 29–40. DOI: 10.1016/j.niox.2021.12.003

34. Yuyun M.F., Ng L.L., Ng G.A. Endothelial dysfunction, endothelial nitric oxide bioavailability, tetrahydrobiopterin, and 5-methyltetrahydrofolate in cardiovascular disease. Where are we with therapy? // Microvasc Res. – 2018. – Vol. 119. – P. 7–12. DOI: 10.1016/j.mvr.2018.03.012