ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИРИБОЗИЛРИБИТОЛФОСФАТА В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИН

Несмотря на мировую практику, в Российской Федерации иммунизация против гемофильной инфекции проводится только у детей из групп риска, что может быть связано с отсутствием производства данной вакцины в РФ. Поэтому разработка технологии получения полирибозилрибитолфосфата (ПРФ, действующее вещество Hib-вакцины) остается актуальной. Ранее сотрудниками ФГУП СПбНИИВС ФМБА России был выделен и идентифицирован штамм Haemophilus influenzae SPB тип b В-7884, подобраны условия его культивирования и первичного выделения ПРФ из культуральной жидкости. Цель работы – изучение возможности исключения стадии центрифугирования для отделения биомассы H. influenzae SPB тип b В-7884 перед осветлением на каскаде фильтровальных дисков, а также разработка последующих этапов выделения ПРФ из полученного промежуточного продукта. Материалы и методы. Выделение ПРФ из инактивированной культуральной жидкости штамма В-7884 проводили при помощи центрифугирования, фильтрации, осаждения, гомогенизации, экстракции при различных условиях. Концентрацию ПРФ в промежуточных продуктах определяли орциноловым методом, подлинность – при помощи реакции латекс-агглютинации. Результаты и обсуждение. Подобрана оптимальная схема выделения и очистки активной фармацевтической субстанции ПРФ, включающая фильтрацию через каскад глубинных фильтров Zeta plus LP 60 (0,3–0,6 мкм) и Zeta plus LP 90 (0,1–0,3 мкм), концентрирование и диафильтрацию на ультрафильтрационных кассетах с номинальным отсечением по молекулярной массе 30 кДа, осаждение 10% раствором цетилтриметиламмония бромида (5% по объему) с последующей гомогенизацией полученного осадка (в присутствии 12,5% этанола от объема концентрата) и экстракцией (32,5% этанола), фильтрацию через глубинные фильтры Zeta Plus SP 30 и угольные фильтры Zeta Plus Carbon R53, а также осаждение 1,0% (по объему) 4,0 M раствором натрия хлорида и заморозку при –(20±2)°С. Заключение. Полученные результаты станут основой для дальнейшей наработки субстанции полисахарида и позволят приступить к следующему этапу разработки технологии вакцины против Haemophilus influenzae тип b – конъюгации с белком-носителем.

1. World Health Organization: Immunization, Vaccines and Biologicals. Haemophilus influenzae type b (Hib). URL: http://www.who.int/immunization/monitoring_surveillance/burden/vpd/surveillance_type/sentinel/Hib/en/ (дата обращения: 29.01.2018).

2. Yang Y., Pan X., Cheng W., Yang Y., Scherpbier R.W., Zhu X., Chen Y., Zhou Y., Jiang Q. Haemophilus influenzae type b carriage and burden of its related diseases in Chinese children: Systematic review and meta-analysis // Vaccine. 2017. Vol. 35. Is. 46. P. 6275–6282. DOI: 10.1016/j.vaccine.2017.09.057

3. Wang S., Tafalla M., Hanssens L., Dolhain J. A review of Haemophilus influenzae disease in Europe from 2000-2014: challenges, successes and the contribution of hexavalent combination vaccines // Expert Rev Vaccines. 2017. Vol. 16. Is. 11. P. 1095–1105. DOI: 10.1080/14760584.2017.1383157

4. Chongmelaxme B., Hammanee M., Phooaphirak W., Kotirum S., Hutubessy R., Chaiyakunapruk N. Economic evaluations of Haemophilus influenzae type b (Hib) vaccine: a systematic review // J Med Econ. 2017. Vol. 20 Is. 10. P. 1094–1106. DOI: 10.1080/13696998.2017.1359181

5. Sakata H., Adachi Y., Morozumi M., Ubukata K. Invasive Haemophilus influenzae infections in children in Kamikawa subprefecture, Hokkaido, Japan, 2006-2015: The effectiveness of H. influenzae type b vaccine // J Infect Chemother. 2017. Vol. 23. Is. 7. P. 459–462. DOI: 10.1016/j.jiac.2017.03.019

6. Yohou K.S., Aka N.L., Noufe S., Douba A., Assi Assi B., Dagnan S.N. Evaluation of introduction of the Haemophilus influenzae vaccine in Côte d’Ivoire [Article in French] // Sante Publique. 2016. Vol. 28. Is. 5. P. 655–664.

7. Casey R.M., Dumolard L., Danovaro-Holliday M.C., Gacic-Dobo M., Diallo M.S., Hampton L.M., Wallace A.S. Global Routine Vaccination Coverage, 2015 // Morb Mortal Wkly Rep (MMWR). 2016. Vol. 65. Is. 45. P. 1270– 1273. DOI: 10.15585/mmwr.mm6545a5

8. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. МР 3.3.1.0001-10 Эпидемиология и вакцинопрофилактика гемофильной инфекции типа b. М, 2010. 32 с.

9. Союз педиатров России. Федеральные клинические рекомендации по вакцинопрофилактике гемофильной инфекции типа b у детей. URL: http://www.pediatr-russia.ru/sites/default/files/file/kr_gemib.pdf (дата обращения: 29.01.2018).

10. Приказ Минздрава России от 21.03.2014 № 125н «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям».

11. Салимова Е.Л., Конон А.Д., Трухин В.П., Петровский С.В., Красильников И.В. Haemophilus influenzae SPB тип b В-7884 – производственный штамм полисахаридных вакцин // Актуальная биотехнология. 2016. № 3 (18). С. 77–81.

12. Трухин В.П., Петровский С.В., Красильников И.В., Начарова Е.П., Евтушенко Ф.Э., Салимова Е.Л., Конон А.Д., Уйба С.В. Штамм Haemophilus influenzae SPB тип в – высокоактивный продуцент капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата. Пат. 2624014 Рос. Федерация N 2016113658; заявл. 08.04.2016; опубл. 30.06.2017, Бюл. N 19. 8 с.

13. Конон А.Д., Салимова Е.Л., Трухин В.П., Петровский С.В., Красильников И.В. Особенности культивирования Haemophilus influenzae SPB тип b В-7884 – продуцента полирибозилрибитолфосфата // Актуальная биотехнология. 2016. № 3 (18). С. 67–71.

14. Салимова Е.Л., Конон А.Д., Басакина И.И., Красильников И.В. Выделение целевого продукта полисахарида полирибозилрибитолфосфата из культуральной жидкости Haemophilus influenzae тип b с целью производства субстанции для полисахаридных вакцин // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инновации в здоровье нации» (г. Санкт-Петербург, 8–9 ноября 2017 г.). С. 337–340.

15. Конон А.Д., Салимова Е.Л., Басакина И.И., Красильников И.В. Оптимизация методики определения концентрации полирибозилрибитолфосфата в процессе производства субстанции для полисахаридных вакцин // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инновации в здоровье нации» (г. Санкт-Петербург, 8–9 ноября 2017 г.). С. 194–198.

16. Junqiang L., Qian S., Qiumin Zh., Yabing L., Hejun L., Yongjie J., inventor; Tasly Pharmaceutical Group Co., Ltd., assignee. Haemophilus influenzae type B polysaccharide conjugate vaccine preparation method. CN103623404 (B). 2016 Aug 03.

17. Acep R., Neni N. Isolation and purification of capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b (Hib) by hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) precipitation and chromatography / Proceeding of The International Seminar on Chemistry. 2008 Oct: 294–296.

18. Hamidi A., Beurret M.F., inventor; De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws, assignee. Process for producing a capsular polysaccharide for use in conjugate vaccines. United States patent. US 7582459 B2. 2009 Sep 1.

19. Ella K.M., Ramasamy V., Naidu M.G., Sarma A.D., inventor; Bharat Biotech International Limited, assignee. Nonalcoholic vaccine compositions free from animal- origin and process for preparation thereof / World intellectual property organization WO 2014009971 (A2). 2014 Jan 16.

20. Wieruszeski J.M., Talaga P., Lippens G. Development of a high-resolution magic-angle spinning nuclear magnetic resonance identity assay of the capsular polysaccharide from Haemophilus influenzae type b present in cetavlon precipitate // Anal Biochem. 2005. Vol. 338. Is. 1. P. 20-25. DOI: 10.1016/j.ab.2004.10.038

21. Biswas S.C., Chattoraj D.K. Polysaccharide-surfactant interaction. 2. Bindingof cationic surfactants to carboxymethyl cellulose and dextrin // Langmuir. 1997. Vol. 13. P. 4512–4519.

22. Bao H., Li L., Gan L.H., Zhang H. Interactions between ionic surfactants and polysaccharides in aqueous solutions // Macromolecules. 2008. Vol. 41.Is. 23. P. 9406–9412.

23. Maulik S., Jana P., Moulik S., Chattoraj D. Biopolymer-surfactant interation. I. Kinetics of binding of cetyltrimethyl ammonium bromide with carboxymethylcellulose // Biopolymers. 1995. Vol. 35. P. 533–541. DOI: 10.1002/ bip.360350512

24. Noyes A., Boesch A., Godavarti R., Titchener-Hooker N., Coffman J., Mukhopadhyay T. High throughput quantification of capsular polysaccharides for multivalent vaccines using precipitation with a cationic surfactant // Vaccine. 2013. Vol. 31. Is. 48. P. 5659–5665. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.09.075

25. Rana R., Dalal J., Singh D., Kumar N., Hanif S., Joshi N., Chhikara M.K. Development and characterization of Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine prepared using different polysaccharide chain lengths // Vaccine. 2015. Vol. 33. Is. 23. P. 2646–2654. DOI: 10.1016/j.vaccine.2015.04.031

26. Abdelhameed A.S., Adams G.G., Morris G.A., Almutairi F.M., Duvivier P., Conrath K., Harding S.E. A glycoconjugate of Haemophilus influenzae Type b capsular polysaccharide with tetanus toxoid protein: hydrodynamic properties mainly influenced by the carbohydrate // Sci Rep. 2016. Vol. 6. P. 22208. DOI: 10.1038/ srep22208

27. Sigma Aldrich: Glycobiology Analysis Manual, 2nd Edition. Lipopolysaccharides. URL: https://www.sigmaaldrich. com/content/dam/sigma-aldrich/articles/biology/Glycobiology/glycobiology-pdf/lipopolysaccharides.pdf (дата обращения: 29.01.2018).

28. Arsang A., Tabatabaie A., Vaziri F., Nejati M., Zolfaghari M.R., Fateh A., Jamnani F.R., Bahrmand A.R., Siadat S.D. Optimization of large scale production of Haemophilus influenzae type b polyribosyl-ribitol phosphate // Minerva Biotecnologica. 2017. Vol. 29. Is. 1. P. 17–23. DOI: 10.23736/S1120-4826.16.01855-3