ВЭЖХ-методика количественного анализа фексофенадина в печени кроликов

Исследование фармакокинетики маркерных субстратов белка-транспортера гликопротеина-Р (Pgp, ABCB1-белка), к которым относится фексофенадин, является одним из способов оценки его функциональной активности.

Цель. Разработка ВЭЖХ-методики количественного определения фексофенадина в печени кроликов.

Материалы и методы. Количественное определение фексофенадина осуществляли с использованием хроматографической системы Stayer («Аквилон», Россия) с УФ детектором UVV 104. Применяли обращенно-фазную хроматографическую колонку Luna C18 100Å (250*4,6) с зернением 5 мкм при температуре 45°С. Определение концентрации фексофенадина проводили методом абсолютной калибровки по площади пиков.

Результаты. Исследование проводили в изократическом режиме. Состав подвижной фазы: вода деионизированная, ацетонитрил и ледяная уксусная кислота в соотношении 267,4:120:4,33, доведенные триэтиламином до pH=6,7. Пробоподготовка заключалась в гомогенизации 500 мг измельченной печени в 500 мкл воды очищенной с последующим центрифугированием (1750 g) и отбором надосадочной жидкости. Осаждение белка осуществлялось ацетонитрилом (2,5 мл), подкисленным 375 мкл кислоты хлористоводородной путем встряхивания на приборе Shaker (500 об./мин). Надосадочный слой переносили в отдельную пробирку, добавляли по 2 мл метилена хлористого, эфира диэтилового и этилацетата и повторно встряхивали 10 мин (при 500 об./мин). Затем центрифугировали (1750 g) и упаривали супернатант на роторно-вакуумном испарителе при 50°С. К сухому остатку добавляли 300 мкл подвижной фазы и 100 мкл инжектировали в хроматограф. Метод был валидирован в линейном диапазоне от 3 до 60 мкг/г фексофенадина с приемлемой внутри- и межцикловой точностью, прецизионностью и стабильностью. Методика была апробирована на кроликах после внутривенного введения им фексофенадина в дозе 11 мг/кг массы.

Заключение. Разработана ВЭЖХ-методика количественного определения фексофенадина в ткани печени кроликов, которая может использоваться для оценки функциональной активности Pgp в доклинических исследованиях.

Список сокращений: Pgp − гликопротеин-Р, ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография, об./мин – оборотов в минуту

1. Sharom F.J. The P-glycoprotein multidrug transporter // Essays. Biochem. 2011. V. 50. P. 161–178. DOI: 0.1042/bse0500161

2. Mollazadeh S., Sahebkar A., Hadizadeh F., Behravan J., Arabzadeh S. Structural and functional aspects of P-glycoprotein and its inhibitors [Text] // Life Sci. 2018. Vol. 214. P. 118–123. DOI: 10.1016/j.lfs.2018.10.048

3. Кукес В.Г., Грачев С.В., Сычев Д.А., Раменская Г.В. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализированной медицины: руководство для врачей. М.: ГЭОТАР-МЕДиа, 2008. 304 c.

4. Chufan E.E., Sim H.M., Ambudkar S.V. Molecular basis of the polyspecificity of P-glycoprotein (ABCB1): recent biochemical and structural studies // Adv. Cancer Res. 2015. Vol. 125. P. 71–96. DOI: 10.1016/bs.acr.2014.10.003

5. Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В., Попова Н.М., Есенина А.С., Градинарь М.М., Якушева Е.Н. Функциональная активность гликопротеина-P на фоне ишемии головного мозга // Наука молодых - Eruditio Juvenium. 2019. Т. 7. № 1. С. 46–52. DOI: 10.23888/hmj20197146-52

6. Якушева Е.Н., Сычев Д.А., Щулькин А.В., Черных И.В., Ма- рия Валериевна Гацанога М.В. Оценка принадлежности лекарственных препаратов к ингибиторам и индукторам белка-транспортера гликопротеина-P в эксперименте in vivo // Экспер.и клин. фармакол. 2018. Т. 81. № 1. С. 17–23.

7. Методические рекомендации по изучению биотрансформации и транспортеров новых лекарственных средств: дизайн исследований, анализданных. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том III. М.: Гриф и К, 2014. 343 с.

8. U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluationand Research. Guidance for industry: drug interaction studiesdstudy design, data analysis, implications for dosing, and labeling recommendations. URL: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm292362.pdf (дата обращения: 15.01.2018)

9. Раменская Г.В., Скуридина Е.А., Красных Л.М. Разработка методики количественного определения маркера активности P-гликопротеина фексофенадина в плазме крови // Хим.-фарм. журн. 2006. Т. 40. № 12. С. 47–50.

10. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В. Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови // Фармакокинетика и фармакодинамика. 2017. № 2. С. 35–38.

11. Черных И.В., Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Гацанога М.В., Попова Н.М., Якушева Е.Н. Метод анализа функциональной активности гликопротеина-P в гематоэнцефалическом барьере // Нейрохимия. 2019. Т. 36. № 1. С. 84–88. DOI: 10.1134/S1027813319010060

12. Bosilkovska M. Samer C.F., Déglon J., Rebsamen M., Staub C., Dayer P., Walder B., Desmeules J.A., Daali Y. Geneva cocktail for cytochrome P450 and P-glycoprotein activity assessment using dried blood spots // Clin. Pharmacol. Ther. 2014. Vol. 96. No 3. P. 349–359. DOI: 10.1038/clpt.2014.83

13. Muppavarapu R., Guttikar S., Rajappan M., Kamarajan K., Mullangi R. Sensitive LC-MS/MS-ESI method for simultaneous determination of montelukast and fexofenadine in human plasma: application to a bioequivalence study // Biomed. Chromatogr. 2014. Vol. 28. No 8. P. 1048–1056. DOI: 10.1002/bmc.3114

14. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Восьмое издание / пер. с англ. под ред. И.В. Белозерцевой, Д.В. Блинова, М.С. Красильщиковой. М.: ИРБИС, 2017. 336 с.

15. Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. М.: Гриф и К, 2013. 328 с.

16. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation (draft guidance). U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2013. URL: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf (дата обращения: 15.01.2018)

17. Guideline on bioanalytical method validation. European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use. London, 2011. URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-bioanalytical-method-validation_en.pdf (дата обращения: 15.01.2018)

18. Эпштейн Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор) // Хим.- фарм. журн. 2004. Т. 38. № 4. С. 40–56.

19. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В. Методика определения принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P // Росс. мед.-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. 2015. Т. 23. № 3. С. 49–53.

20. Molimard М., Diquet B., Benedetti M.S. Comparison of pharmacokinetics and metabolism of desloratadine, fexofenadine, levocetirizine and mizolastine in humans // Fund. & Clin. Pharmacol. 2004. Vol. 18. No 4. P. 399–411. DOI: 10.1111/j.1472-8206.2004.00254.x

21. Ballent M., Wilkens M.R., Mate L., Muscher A.S., Virkel G., Sallovitz J., Schröder B., Lanusse C., Lifschitz A. P-glycoprotein in sheep liver and small intestine: gene expression and transport efflux activity // J. Vet. Pharmacol. Ther. 2013. Vol. 36. No 6. Р. 576–582. DOI: 10.1111/jvp.12040

22. Hagenbuch B., Gao B., Meier P.J. Transport of Xenobiotics Across the Blood-Brain Barrier // News Physiol. Sci. 2002. No. 17. P. 231–234. DOI: 10.1152/nips.01402.2002

23. van Veen H.W., Margolles A., Muller M., Higgins C.F., Konings W.N. The homodimeric ATP-binding cassette transporter LmrA mediates multidrug transport by an alternating two-site (two-cylinder engine) mechanism // EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 2503–2514.

24. Le Cluysell E.L. Pregnane X receptor: molecular basis for special differences in CYP3A induction by xenobiotics // Chem. Biol. Interact. 2001. Vol. 134. No 3. P. 283–289.

25. Moore L.B., Maglich J.M., McKee D.D., Wisely B., Willson T.M., Kliewer S.A., Lambert M.H., Moore J.T. Pregnane X receptor (PXR), constitutive androstane receptor (CAR), and benzoate X receptor (BXR) define three pharmacologically distinct classes of nuclear receptors // Mol. Endocrine. 2002. Vol. 16. No 5. P. 977–986. DOI: 10.1210/mend.16.5.0828