РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ПРЕДКОЛОНОЧНОЙ ДЕРИВАТИЗАЦИИ ГЛУТАТИОНА ВОССТАНОВЛЕННОГО 4-МЕТОКСИ-2-НИТРОФЕНИЛ- ИЗОТИОЦИОНАТОМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

В настоящее время активно исследуется фармакологическая роль глутатиона в терапии канцерогенеза, нервно-дегенеративных и глазных болезней, заболеваний сердца, иммунной системы и старения организма. Поэтому для разработки фармацевтических объектов на его основе необходимо создание оптимальной
аналитической базы. Целью настоящего исследования является разработка методики анализа глутатиона восстановленного с помощью предколоночной дериватизации 4-метокси-2-нитрофенил-изотиоцианатом. Материалы и методы. Поскольку глутатион не имеет необходимых спектральных характеристик для непосредственного анализа, то исходя из этого, разработана методика определения глутатиона с помощью предколоночной дериватизации 4-метокси-2-нитрофенил-изотиоцианатом методом обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Детекцию образовавшегося деривата проводили по поглощению в УФ-свете с помощью диодно-матричного детектора. Результаты и обсуждение. В ходе описанного эксперимента, были получены хроматограммы деривата глулатиона с 4-метокси-2-нитрофенил-изотиоцианатом. Данную методику также оценивали на возможность количественного определения глутатиона. Чувствительность методики составила 0,01% или 3,1*10-1 моль. Прямолинейная зависимость между аналитическим сигналом (площадь пика) и концентрацией наблюдалась в диапазоне 0,01–0,08%, коэффициент корреляции – 0,995. Заключение. В ходе проведённых исследований разработана методика определения глутатиона с помощью предколоночной дериватизации 4-метокси-2-нитрофенил-изотиоцианатом методом ОФ ВЭЖХ. При этом образуется дериват со временем удерживания 22,3 мин и максимумом поглощения 398 нм. Также данная методика позволяет оценить количественное содержание исследуемого объекта.

глутатион восстановленный, 4-метокси-2-нитрофенил-изотиоцианат, обращен- но-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография, дериватизация

1. Dickinson D.A., Forman H.J. Cellular glutathione and thiols metabolism // Biochem. Pharmacol. 2012. Vol. 64.P. 1019–1026.

2. Forman H.J., Dickinson D.A. Oxidative signaling and glutathione synthesis // Biofactors. 2003. Vol. 17. P. 1–12.

3. Liu H., Wang H., Shenvis S., Hagen T.M., Liu R.M. Glutathione metabolism during aging and in Alzheimer disease // Ann.N.Y.Acad.Sci. 2004. Vol. 1019. P. 346–349.

4. Wang H., Liu H., Liu R.M. Gender difference in glutathione metabolism during aging in mice, Exp. Gerontology. 2003. Vol. 38. P. 507–517.

5. De Leve L., Kaplowitz N. Importance and regulation of hepatic GSH // Sem.Liver.Dis. 1990. Vol. 10. P. 251–266.

6. Meister A., Anderson M. E. Glutathione // Ann.Rev.Biochem. 1983. Vol. 52. P. 711–760.

7. Hogg N. The biochemistry and physiology of S-nitrosothiols // Ann.Rev. Pharmacol.Toxicol. 2002. Vol. 42. Vol. 585–600.

8. Oja S.S., Janaky R., Varga V., Saranasaari P. Modulation of glutamate receptor functions by glutathione //Neurochem.Int. 2000. Vol. 37. P. 299–306.

9. Pompella A., Visvikis A., Paolicchi A., De Tata V., Casini A.F. The changing faces of glutathione, a cellularprotagonist // Biochem Pharmacol. 2003. Vol. 66. P. 1499–1503.

10. Forman H.J., Zhang H., Rinn A. Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis // Mol.Aspects.Med. 2009. Vol. 30. P. 1–12.

11. Woodbridge J.E. Glutathione reagent and test method. United States Patent: 3864085A. 1975.

12. Hissin P.J., Hilf R.A fluorometric method or determination of oxidized and reducedglutathione in tissues // Anal. Biochem. 1976. Vol. 74. P. 214-226.

13. Agrawal S.B., Agrawal M., Lee E.H., Kramert G.F. Changes in polyamine andglutathione contents of a green alga, Chlorogonium elongatum (dang) france exposedto mercury // Environ.Exp.Botany. 1992. Vol. 32. P. 145–151.

14. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch.Biochem.Biophys. 1959. Vol. 82. P. 70–81.

15. Sutariya V., Wehrung D., Geldenhuys W.J. Development and validation of a novel RP-HPLC method for the analysis of reduced glutathione // J. Chromatogr.Sci. 2012. Vol. 50. Is. 3. P. 271–276.

16. Iwasaki Y., Saito Y., Nakano Y., Mochizuki K., Sakata O., Ito R., Saito K., Nakazawa H. Chromatographic and mass spectrometric analysis of glutathione in biological samples // J.Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. LifeSci. 2009. Vol. 877. Is. 28. P. 3309–3317.

17. Di Pietra A.M., Gotti R., Bonazzi D., Andrisano V., Carvini V. HPLC determination of glutathione and L-cysteine in pharmaceuticals after derivatization with ethacrynic acid // J.Pharm.Biomed.Anal. 2013. Vol. 12. Is. 1. P. 91–98.

18. Giustarini, D., Dally-Donne I., Milzani A., Fanty P., Rossi R. Analysis of GSH and GSSG after derivatization with N-ethylmaleimide // Nat.Protoc. 2013. Vol. 8. P. 1660-1669.

19. Lee S., Yim J., Lim K., Kim J. Validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method to measure oxidized and reduced forms of glutathione in whole blood and verification in a mouse model as an indicator of oxidative stress // J.Chromatogr.B. 2016. Vol. 1019. P. 45–50.

20. Gawlik M., Krzyżanowska W., Gawlik M.B., Filip M. Optimization of determination of reduced and oxidized glutathione in rat striatum by HPLC method with fluorescence detection and pre-column derivatization // Acta Chromatographica. 2014. Vol. 36. P. 335–345.

21. Bald E., Głowacki R. Analysis of saliva for glutathione and metabolically related thiols by liquid chromatography with ultraviolet detection // Amino Acids. 2005. Vol. 28. Is. 4. P. 431–433.

22. Yan M., G.-B. Shi G., Sui Y., Guo T., Zhang J.-W., Fan S.-J. Determination of reduced glutathione in human plasma by RP-HPLC // Pharmaceutical Journal of Chinese People’s Liberation Army. 2008. Vol. 3. P. 251–253.

23. Safavi A., Maleki N., Farjami E., Aghakhani Mahyari F. Simultaneous Electrochemical Determination of Glutathione and Glutathione Disulfide at a Nanoscale Copper Hydroxide Composite Carbon Ionic Liquid Electrode, Analytical Chemistry. 2009. Vol. 81. Is. 18. P. 7538–7543.

24. Raoof J., Ojani R., Karimi-Maleh H. Electrocatalytic oxidation of glutathione at carbon paste electrode modified with 2,7-bis (ferrocenyl ethyl) fluoren-9-one: application as a voltammetric sensor // Journal of Applied Electrochemistry. 2009. Vol. 39. Is. 8. P. 1169–1175.

25. European Pharmacopoeia. 8th ed. – European Directorate for Quality of Medicines and Health care. Strasbourg, France; 2014. 2727 p.