Разработка методики культивирования эксплантов органа Корти in vitro с использованием полиэтиленимина

Цель. Разработать методику культивирования эксплантов органа Корти in vitro с использованием полиэтиленимина (PEI) в качестве адгезивного субстрата. В исследовании оценивалась перспективность применения PEI в качестве эффективной альтернативы существующим субстратам для культивирования образцов внутреннего уха in vitro.

Материалы и методы. В работе использовали экспланты органа Корти, полученные от новорождённых мышей (P1–P2). Стеклянные культуральные поверхности обрабатывали раствором PEI с последующей обработкой фетальной бычьей сывороткой. Для оценки пригодности использования разработанной модели эксплантов в изучении ототоксичности проводили обработку гентамицином. В качестве отопротектора использовали изоликвиритигенин. В исследовании проводился морфологический анализ изображений, полученных с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. В результате оценена выживаемость волосковых клеток после окрашивания фаллоидином, меченным Alexa Fluor 488. Проведена оценка величины стереоцилиарных углов наружных волосковых клеток.

Результаты. PEI-покрытие обеспечило надежную фиксацию эксплантов органа Корти (до 72 ч) без признаков открепления от культуральной поверхности. Образцы сохраняли прочность прикрепления через два этапа смены культуральной среды и последующие 16 циклов промывки в процессе флуоресцентного окрашивания. Морфологический анализ контрольной группы не выявил признаков токсического воздействия PEI на волосковые клетки. Органотипическая модель с использованием PEI-покрытия позволила воспроизвести классическую картину гентамицин-индуцированной ототоксичности с базально-апикальным градиентом повреждения. Впервые с помощью данной модели продемонстрирован отопротекторный эффект изоликвиритигенина (1 мкМ) против гентамицин-индуцированной ототоксичности (500 мкМ), наиболее выраженный в среднем отделе улитки как для внутренних, так и для наружных волосковых клеток (p <0,0001 для обоих сравнений с группой гентамицина).

Заключение. Впервые показана эффективность PEI как альтернативного субстрата для культивирования образцов внутреннего уха, продемонстрировавшего оптимальные адгезивные свойства и с отсутствием собственной токсичности. Разработанная нами методика представляет перспективный подход для исследований ототоксичности и скрининга отопротекторов.

1. Chadha S., Kamenov K., Cieza A. The World Report on Hearing, 2021 // Bull World Health Organ. – 2021. – Vol. 99, No. 4. – P. 242–242A. DOI: 10.2471/BLT.21.285643

2. Sheffield A.M., Smith R.J.H. The Epidemiology of Deafness // Cold Spring Harb Perspect Med. – 2019. – Vol. 9, No. 9. – P. a033258. DOI: 10.1101/cshperspect.a033258

3. Tripathi P., Deshmukh P. Sudden Sensorineural Hearing Loss: A Review // Cureus. – 2022. – Vol. 14, No. 9. – P. e29458. DOI: 10.7759/cureus.29458

4. Ganesan P., Schmiedge J., Manchaiah V., Swapna S., Dhandayutham S., Kothandaraman P.P. Ototoxicity: A Challenge in Diagnosis and Treatment // J Audiol Otol. – 2018. – Vol. 22, No. 2. – P. 59–68. DOI: 10.7874/jao.2017.00360

5. Остроумова О.Д., Ших Е.В., Реброва Е.В., Рязанова А.Ю., Переверзев А.П. Лекарственно-индуцированная тугоухость как проявление лекарственно-индуцированной ототоксичности // Вестник оториноларингологии. – 2019 – Т.4, № 84. – С. 72–80. DOI: 10.17116/otorino20198404172. EDN: FNAVOC

6. Pasdelou M.P., Byelyayeva L., Malmström S., Pucheu S., Peytavy M., Laullier H., Hodges D.B. Jr, Tzafriri A.R., Naert G. Ototoxicity: A High Risk to Auditory Function That Needs to Be Monitored in Drug Development // Mol Neurosci. – 2024. – Vol. 17. – P. 1379743. DOI: 10.3389/fnmol.2024.1379743

7. Reynard P., Thai-Van H. Drug-induced hearing loss: Listening to the latest advances // Therapie. – 2024. Vol. 79, No. 2. – P. 283–295. DOI: 10.1016/j.therap.2023.10.011

8. Phillips O.R., Baguley D.M., Pearson S.E., Akeroyd M.A. The long-term impacts of hearing loss, tinnitus and poor balance on the quality of life of people living with and beyond cancer after platinum-based chemotherapy: literature review // J Cancer Surviv. – 2023. – Vol. 17, No. 1. – P. 40–58. DOI: 10.1007/s11764-022-01314-9.

9. Шубникова Е.В., Вельц Н.Ю. Ототоксичность аминогликозидов: современные представления // Антибиотики и химиотерапия. – 2022. – Т. 67, № 11–12. – С. 79–90. DOI: 10.37489/0235-2990-2022-67-11-12-79-90. EDN: FVHSRQ

10. Frisch S.M., Francis H. Disruption of Epithelial Cell-Matrix Interactions Induces Apoptosis // J Cell Biol. – 1994. – Vol. 124, No. 4. – P. 619–626. DOI: 10.1083/jcb.124.4.619

11. Freshney R.I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 6th ed. – Hoboken: John Wiley & Sons, Inc., 2010. – 732 p. DOI: 10.1002/9780470649367

12. Levano S., Lu Y., Cortada M., Bodmer D. Whole Neonatal Cochlear Explants as an In Vitro Model // J Vis Exp. – 2023. – No. 197. DOI: 10.3791/65160

13. Zhang L.W., Cang X.H., Chen Y., Guan M.X. In Vitro Culture of Mammalian Inner Ear Hair Cells // J Zhejiang Univ-Sci B. – 2019. – Vol. 20, No. 2. – P. 170–179. DOI: 10.1631/jzus.B1700613

14. Landegger L.D., Dilwali S., Stankovic K.M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research // J Vis Exp. – 2017. – No. 124. – P. 55704. DOI: 10.3791/55704

15. Vancha A.R., Govindaraju S., Parsa K.V., Jasti M., González-García M., Ballestero R.P. Use of Polyethyleneimine Polymer in Cell Culture as Attachment Factor and Lipofection Enhancer // BMC Biotechnol. – 2004. – Vol. 4. – P. 23. DOI: 10.1186/1472-6750-4-23

16. Bledi Y., Domb A.J., Linial M. Culturing Neuronal Cells on Surfaces Coated by a Novel Polyethyleneimine-Based Polymer // Brain Res Protoc. – 2000. – Vol. 5, No. 3. – P. 282–289. DOI: 10.1016/S1385-299X(00)00024-6

17. Polikarpov E.V., Kozin, S.V., Smolyarchuk E., Savostyanov K., Mirontsev A.V., Sologova S., Chasovnikova V.V., Eremeeva K.V., Fisenko A., Kudlay D., Bakaeva Z. Cochlear isolation in neonatal mice for in vitro and ex vivo models: an anatomical landmark-based protocol // Front Pharmacol. – 2026. – Vol. 17. – P. 1727526. DOI: 10.3389/fphar.2026.1727526

18. Gao K., Ding D., Sun H., Roth J., Salvi R. Kanamycin Damages Early Postnatal, but Not Adult Spiral Ganglion Neurons // Neurotox Res. – 2017. – Vol. 32, No. 4. – P. 603–613. DOI: 10.1007/s12640-017-9773-2

19. Zgodova A., Pavlova S., Nekrasova A., Boyarkin D., Pinelis V., Surin A., Bakaeva Z. Isoliquiritigenin Protects Neuronal Cells against Glutamate Excitotoxicity // Membranes – 2022. – Vol. 12, No. 11. – P. 1052. DOI: 10.3390/membranes12111052

20. Zhang B., Hu Y., Du H., Han S., Ren L., Cheng H., Wang Y., Gao X., Zheng S., Cui Q., Tian L., Liu T., Sun J., Chai R. Tissue Engineering Strategies for Spiral Ganglion Neuron Protection and Regeneration // J Nanobiotechnology. – 2024. – Vol. 22, No. 1. – P. 458. DOI: 10.1186/s12951-024-02742-8

21. Qi J., Huang W., Lu Y., Yang X., Zhou Y., Chen T., Wang X., Yu Y., Sun J.Q., Chai R. Stem Cell-Based Hair Cell Regeneration and Therapy in the Inner Ear // Neurosci Bull. – 2024. – Vol. 40, No. 1. – P. 113–126. DOI: 10.1007/s12264-023-01130-w

22. Yang M., You D., Liu G., Lu Y., Yang G., O’Brien T., Henshall D.C., Hardiman O., Cai L., Liu M., Shen S. Polyethyleneimine Facilitates the Growth and Electrophysiological Characterization of iPSC-Derived Motor Neurons // Sci Rep. – 2024. – Vol. 14, No. 1. – P. 26106. DOI: 10.1038/s41598-024-77710-1

23. Son E.J., Wu L., Yoon H., Kim S., Choi J.Y., Bok J. Developmental gene expression profiling along the tonotopic axis of the mouse cochlea // PLoS One. – 2012. – Vol. 7, No. 7. – Р. e40735. DOI: 10.1371/journal.pone.0040735

24. Draf C., Wyrick T., Chavez E., Pak K., Kurabi A., Leichtle A., Dazert S., Ryan A.F. A Screen of Autophagy Compounds Implicates the Proteasome in Mammalian Aminoglycoside-Induced Hair Cell Damage // Front. Cell Dev. Biol. – 2021. – Vol. 9. – P. 762751. DOI: 10.3389/fcell.2021.762751

25. Chen Y., Luo X., Deng Y., Zhu G., Chu X., Zhu J., Shao S., Zhang L., Chen X., Chen Y., Lin C., Ge G., Wu S. Isoliquiritigenin Attenuates Cisplatin-Induced Hearing Loss and Ototoxicity by Activating the Keap1-Nrf2-ARE Pathway // Free Radic Biol Med. – 2025. – Vol. 241. – P. 599–616. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2025.10

26. Qiu M., Ma K., Zhang J., Zhao Z., Wang S., Wang Q., Xu H. Isoliquiritigenin as a modulator of the Nrf2 signaling pathway: potential therapeutic implications // Front Pharmacol. – 2024. – Vol. 15. – P. 1395735. DOI: 10.3389/fphar.2024.1395735